DNAbarcoding

DNA Barcoding

As a few asked, a great biohack is the quick and dirty barcoding recipe (french) that can now be quickly found in this wiki. Original link

The original scientific (english) paper

La version Quick and Dirty du DNA Barcoding Thomas Landrain, Marc Fournié, Julien Couaillier et Sam - La Paillasse.org

A - Introduction et explication

Le DNA barcoding est une méthode d'analyse biologique très utile pour déterminer une signature génétique. Grace au DNA barcoding il vous est possible de connaitre de l'espèce d'une plante, d'un animal, d'un champignon, d'une bactérie,… Il vous est également possible de déterminer si un aliment est OGM ou pas. Et il est enfin possible de déterminer l'origine des viandes alimentaires (morceaux crus ou cuits) dans des produits agro-alimentaires et la présence de mélange de viande venant d'animaux d'espèces différentes. Le DNA barcoding est une méthode très utile pour toutes personnes souhaitant obtenir des réponses à ses questions.

A La Paillasse, nous organisons régulièrement des ateliers d'initiation au DNA barcoding, analysant différents types d'espèces (végétales, animales, bactériennes, humaines…). Cependant depuis les récents scandales agroalimentaires sur la viande de cheval, nous proposons des ateliers spécifiquement pour que vous puisiez apprendre à déterminer de quoi sont faites vos lasagne ;)

Le DNA barcoding est une méthode d'analyse qui peut être longue et couteuse. Ainsi il vous coutera environ 200 euros et un délai de 3 jours pour obtenir une analyse venant du leader européen Eurogentec (http://www.eurogentec.com/eu-home.html). C'est beaucoup trop long et trop cher pour un atelier de biohacking. Sentant l'intérêt qu'un tel outil pourrait avoir chez les citoyens concernés, je me suis donc attelé à la tache de cracker les méthodes actuelles et de mettre au point une méthode de DNA barcoding la moins chère et la plus rapide possible : du DNA barcoding en mode Quick and Dirty (rapide et sale pour les non-anglophone).

Voici les trois principales étapes d'un protocole de DNA barcoding:

1- Extraction d'ADN provenant de l'échantillon à analyser 2- Réaction de PCR pour sélectionner et obtenir les séquences d'ADN à analyser 3- Analyse des séquences (gel d'électrophorèse et séquencage)

A- Gagner du temps et limiter les frais

Les étapes d'extraction et d'analyse sont les plus couteuses en temps. La réaction de PCR est malheureusement incompressible encore aujourd'hui (environ 2h). La première étape peut prendre jusqu'à plusieurs heures pour une extraction "propre" (en utilisant du phénol/chloroforme, c'est toxique donc pas conseillé dans un garage). Il y a clairement du temps à gagner sur cette étape si on sacrifie un peu de sensibilité à la méthode. On peut également chercher à utiliser des produits plus propres et moins toxiques, et si possible plus accessible au commun des mortels. Pour obtenir de l'ADN cellulaire de bonne qualité, il faut (au moins) casser les cellules et séparer l'ADN des protéines et des lipides. On va voir comment réaliser cela dans la suite du doc. La troisième étape, l'analyse, peut se faire en utilisant deux méthodes différentes : par génotypage ou séquencage. La première consiste à ne pas analyser entièrement la séquence d'ADN sélectionnée (comme dans la seconde méthode) mais à en déterminer la longueur. En effet, les mutations séparant les génomes de deux espèces distinctes peut rendre des séquences non pas seulement différentes mais plus ou moins longues à certains locus de leur génome. Et c'est observant la taille de ces séquences que l'on détermine l'espèce. Et quand il s'agit de déterminer la longueur d'une séquence, l'électrophorèse est la simple et la plus rapide des méthodes. Un séquencage couterait environ 5 euros par échantillon à analyser (on l'envoie à une entreprise spécialisée, ici c'est GATC la moins chère) et nécessite environ 2 à 3 jours (entre temps d'envoi et analyse) pour obtenir un résultat. Ainsi même si le séquencage reste la méthode la plus sûre pour identifier une espèce, le génotypage par comparaison de longueur de locus reste la plus rapide et la moins chère.

B- Une méthode d'extraction d'ADN en mode Quick and Dirty mais qui reste de qualité suffisante pour réaliser un genotypage.

On trouve sur internet une variété intéressante de méthode d'extraction d'ADN pour les enfants en utilisant du produit vaisselle et un peu d'alcool fort. Ces méthodes, mêmes si fun et jolies à regarder, ne sont pas adéquates pour le génotypage/séquencage car l'ADN n'est pas bien séparé du reste des constituant cellulaire, et si on l'utilise quand même cela aboutira à un échec de la réaction de PCR car l'enzyme principal, l'ADN polymérase, a besoin d'un environnement bien défini et stable pour travailler. Ici le but est de séparer au mieux l'ADN du reste tout en le conservant dans le meilleur état possible. Pour ce faire, j'ai décidé de m'inspirer des protocoles utilisés dans les laboratoires travaillant avec des souris mutantes. Ces dernières sont sélectionnées pour leur génotype particulier et afin de s'assurer que les souris utilisées pour leurs expériences possèdent bien le génotype recherché, les chercheurs utilisent une méthode de DNA barcoding sur un échantillon de peau venant de la queue. Parce qu'ils doivent réaliser ce type de vérification fréquemment et surtout sur un grand nombre de souris, les protocoles utilisés sont souvent optimisés pour gagner du temps. Leur protocole est simple: 1- utiliser une base (généralement de la soude) pour dissoudre les lipides membranaires des cellules, libérant ainsi leur contenu. 2- faire bouillir pour dénaturer les protéines et autres constituants cellulaires. L'ADN reste relativement stable à haute température pendant de courtes périodes (quelques heures max). 3- neutraliser le pH avec de l'acide. 4- centrifuger et récupérer l'ADN dans le surnageant (la partie aqueuse qui est alors purifiée des débris tombés au fond du tube dans ce qu'on appelle le culot)

Au final, la procédure est rapide (environ 30 minutes) et n'utilise que peu d'éléments et de réactifs. C'est une méthode un peu barbare par rapport au standard utilisé dans la discipline mais elle aura l'avantage de produire un ADN utilisable en PCR pour pas cher et rapidement. D'où l'appellation "Quick and Dirty" :)

C- La PCR - Sélection et amplification des séquences ADN recherchées.

La réaction de PCR (Polymerase Chain Reaction) est un des piliers de la biologie moderne. Elle permet de lire, de copier et d'assembler des brins d'ADN ensemble. Toutes les dernières révolutions en génomique font en général appel à la PCR. Bien que les principes de bases de cette réaction soient simples à comprendre, la PCR reste une étape dont l'optimisation est souvent fréquente et nécessaire pour le bon déroulement de l'expérience. Ici je me suis appuyé sur la méthode mise au point par une équipe japonaise en 1999 (Matsunaga, T. et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Science 51, 143–148 (1999)). [Si vous ne trouvez pas l'article, demandez-le sur la mailing list]. Ils proposent une approche intéressante permettant de détecter facilement la présence d'une grande variété d'espèces animales productrices de viande, ainsi que des mélanges de celles-ci, en une seule et même réaction de PCR.

Video explicative de la PCR (en anglais) http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU De manière incroyable, je n'ai pas réussi à trouver de video en français!

D- Obtenir une réponse rapidement - Analyse des séquences par électrophorèse et visualisation des résultats sur un transilluminateur

Une fois que les séquences cibles ont été amplifiées par PCR, il nous faut déterminer la taille des séquences dans chacun des tubes. Pour ce faire on utilise une méthode très courante en laboratoire : l'électrophorèse. Son principe est simple: on place notre échantillon de PCR dans un puits à l'extrémité d'un gel composé d'agarose (généralement à une concentration de 1% - 1g pour 100mL) dans un tampon de migration (ici du TAE). L'ADN dans le gel est chargé négativement et se déplacera dans la matrice d'agarose vers l'anode (soit l'électrode positive). Plus les séquences d'ADN sont longues, plus il devient contraignant pour le brin d'ADN de se déplacer dans les mailles du gel. Ainsi un brin court migrera plus vite qu'un brin long. Au final on est capable de différencier les différents brin entre eux et même de déterminer leur taille approximative en utilisant une échelle de référence (collection de brins d'ADN de taille connue) qui migre en parallèle. Pour visualiser l'ADN, il faut utiliser un intermédiaire, un colorant, car l'ADN est invisible à l'oeil nu. Il en existe plusieurs types aux caractéristiques différentes. La plupart sont dits intercalants, c'est-à-dire qu'ils viennent se placer au sein du sillon de la double hélice d'ADN. Au final, lorsque l'on observe un gel d'electropherese, on ne fait que voir le colorant se déplaçant avec l'ADN. Les colorants sont soit visibles à la lumière du jour (bleu de coomassie), soit fluorescents (bromide d'etidium, midori green,…). On utilise des colorants fluorescent pour leur plus grande sensibilité. Pour observer un colorant fluorescent on doit d'abord l'exciter avec une certaine longueur d'onde de lumière (en général des UV ou de la lumière bleue), puis filtrer la lumière qu'il émet après excitation en utilisant un filtre optique. Pour réaliser cette opération on utilise ce qu'on appelle un transilluminateur. C'est un appareil qui émet sur une surface plane une lumière d'une certaine longueur d'onde de manière homogène. A La Paillasse nous utilisons un appareil que nous avons nous-mêmes mis au point, on l'appelle le BlueNote. Tout le monde peut le fabriquer pour quelques euros quand les appareils commerciaux coutent au minimum entre 1000 et 2000 euros…

Video en français http://www.youtube.com/watch?v=VWAMz6WLwM0 Video (en anglais) http://www.youtube.com/watch?v=QEG8dz7cbnY Wikipedia http://en.wikipedia.org/wiki/Gel_electrophoresis

B- Le matériel nécessaire

Tous les équipements, consommables et réactifs nécessaires sont aujourd'hui accessibles à l'amateur motivé.

1- L'equipement (* assez difficile à trouver -> privilégier un équipement DIY OpenHardware).

- *Une machine PCR [DIY: openPCR project - http://openpcr.org/main/buildit] - *Un système d'electrophorese (cuve et générateur) [DIY: tupperware, fil en cuivre et pile de 9V en série - http://openwetware.org/wiki/DIYbio:Notebook/Open_Gel_Box_2.0/RFC1] - *Une centrifugeuse pour microtube [DIY: Dremelfuge et gogofuge projects - http://diybio.org/2010/03/21/dremelfuge/] - *Un transilluminateur [DIY: BlueNote project made in La Paillasse] - Un congélateur pour conserver le MasterMix PCR et les amorces - Une plaque chauffante - Une balance mesurant au microgramme. - Un micro-onde - Un vortex - *Micropipettes (permettant de pipetter des volumes entre 1uL et 1000uL - se trouve sur Alibaba.com pour pas trop cher) - Un couteau bien aiguisé ou un scalpel. (une lame de rasoir fonctionne aussi) - Une casserole pour faire bouillir de l'eau - Un récipient en verre d'au moins 200mL

Il y a trois approches pour réunir tout ce matériel: - Le plus simple est encore de vous rendre dans votre biohackerspace local :) - Les fabriquer soi-même. Des versions DIY existent aujourd'hui - eBay permet de s'en procurer pour pas trop cher.

2- Le consommable

- microtubes de 1,5mL ou 2mL - microtubes PCR (0.2mL) - Tubes de 50mL ou bouteilles propres pour contenir les réactifs. - pointes pour micropipettes - cure-dents - portoirs pour microtube (dont un en mousse pour l'ébullition des échantillons)

3- Les réactifs

- Soude (NaOH) - en poudre ou liquide (se trouve en supermarché) - Acide chlorhydrique (HCl) - liquide (se trouve en supermarché) - MasterMix PCR - On utilise le DreamTaq Green PCR MasterMix (2X) qui est très pratique et pas trop cher (environ 50 centimes la réaction de PCR - acheté chez Thermo Scientific) - Echelle de reference pour l'electrophorese - 100bp GeneRuler DNA ladder (acheté chez Thermo Scientific) - Les amorces ADN pour la PCR (dépend de ce que l'on cherche à génotyper). A La Paillasse, on les commande chez Sigma Aldrich. - Colorant ADN - On utilise le midori green (colorant non carcinogène et excitable par de la lumière bleue contrairement au bromide d'etidium - acheté chez Dutscher). Le SYBR Safe ou le GelGreen marchent aussi avec la lumière bleue (à 470nm) - TAE 10X (Tris Acetate EDTA) ou TBE 10X (Tris Borate EDTA) - Agarose ou agar (l'agarose donne des gels de bien meilleur qualité pour l'analyse des résultats mais est plus cher) - Eau (déminéralisée pour réaliser les réactifs). L'eau du robinet est ok pour les réactifs de l'électrophorèse.

C- Le protocole détaillé (Au boulot !)

Temps Total: 4h (routine) - 6h (workshop) - Prix: environ 3-5 euros par analyse (si on n'amortit pas le matériel)

I EXTRACTION

1- Découper des échantillons d'environ 50µg (si vous n'avez pas de balance de précision, ça fait environ entre un et trois mm3) et les placer individuellement dans des microtubes (1,5 ou 2mL) que vous aurez numéroté au préalable. Laver préalablement et entre chaque découpe d'échantillons différents le couteau à l'eau de javel dilué (l'ADN s'y dissout) puis à l'alcool à 90° et enfin une nouvelle fois à l'eau de javel dilué. C'est très important pour éviter les contaminations entre échantillons.

2- Pipetter environ 100 à 200uL de solution de NaOH (soude) à 200mM (millimolaires). But : La soude va faire éclater les membranes lipidiques des cellules et permettre à l'ADN d'en être extrait

3- Ecraser le morceau de viande dans le tube à l'aide de votre pipette ou avec un cure-dent puis agiter à l'aide d'un vortex (si vous en avez un à votre disposition).

4- Faire bouillir une casserole d'eau , placer les tubes dans un porte tube flottant en mousse et laisser les tubes dans l'eau en ébullition pendant 10 minutes (trop longtemps et l'ADN se dégrade) But: Dénaturer (détruire) les protéines de l'échantillon qui peuvent perturber/dégrader l'ADN et inhiber la réaction de PCR.

5- Agiter (à l'aide d'un vortex si vous en avez un à votre disposition)

6- Pipetter environ 100 à 200uL (impérativement utiliser le même volume qu'en étape 2 !!) de solution d'HCl (acide chlorhydrique) à 200mM dans chaque tube. But : Neutraliser le pH.

7- Agiter (à l'aide d'un vortex si vous en avez un à votre disposition)

8- Centrifuger les tubes à grande vitesse (au moins 10000g) à 14000 tours/min dans une petite centrifugeuse de paillasse (ou en utilisant une dremelfuge) pendant 10 minutes Sécurité: Faire bien attention à la bonne répartition des tubes , face à face pour un bon équilibrage dans la centrifugeuse : sinon risque de déséquilibre et à 14000 tours/min ça peut représenter des dégâts sévères pour la machine et vous. But : Faire tomber au fond du tube les débris cellulaire par centrifugation (décantation accéléré), l'ADN restera dans la phase aqueuse puisqu'il est soluble dans l'eau.

9- Mettre le tube de coté en prenant soin de le manipuler avec souplesse afin d'éviter la resuspension du culot dans le surnageant.

Temps Total : 30 minutes

II PCR

1- Préparer les amorces à la bonne concentration dans de l'eau pure (garantie sans nuclease). En générale on prépare une solution mère à 10uM mais le protocole de Matsunaga est légèrement diffèrent dans le fait qu'il mélange toutes les amorces ensemble. C'est ce qui fait son intérêt ici puisque une seul réaction de PCR permet de détecter jusqu'à 6 espèces différentes dans le même échantillon.

2- Utilisez 30uL comme volume final pour la réaction de PCR. Ici on utilisera donc 15uL de MasterMix 2X afin de le diluer deux fois lorsqu'au volume final. Le masterMix contient tous les éléments nécessaire à la réaction de PCR sauf les amorces et l'ADN à analyser. On y trouve l'ADN polymerase, les nucleotides et le milieu tamponné nécessaire à la bonne fonction de l'enzyme. Les réactions se font dans des tubes PCR spécifiques. Ici nous utilisons des tubes de 0.2mL.

3- Compléter les 15uL de MaterMix avec le volume nécessaire d'amorces, de l'eau si nécessaire et 1uL d'ADN à tester (il s'agit ici du surnageant obtenu après centrifugation lors de l'étape d'extraction d'ADN)

4- Bien refermer les tubes, homogénéiser le contenu en tapotant sur les tubes avec votre doigt. Si du liquide s'est glissé dans le capuchon du tube, donner un brève coup de centrifugeuse pour faire retomber les gouttes dans le fond du tube.

5- Le programme de la machine PCR à utiliser avec ces amorces est le suivant:

1- 95°C 5 mn   But : Première phase de dénaturation

2- 95°C 30 secondes But : Dénaturation - Séparation des brins d'ADN 3- 66°C 30 secondes But : Appareillement des amorces avec leur cible (Annealing) 4- 72°C 1 minute But : Elongation - L'ADN polymerase synthétise la séquence cible. [répéter les étapes 2 à 4 : 35x]

5- 72°C 5 minutes But : Elongation Finale

Temps Total : 2 heures pour la PCR et 20 minutes de préparation.

III Electrophorèse

1- Préparer le TAE à sa concentration finale de 1X. Vous devez le diluer 10 fois. Vous pouvez utiliser de l'eau du robinet à cette étape.

2- Peser suffisamment d'agarose pour réaliser un gel à 2% d'agarose et le mélanger avec le TAE dans un récipient en verre (erlenmeyer) (2g pour 100mL - nous utilisons ici une concentration élevée d'agarose car les fragments d'ADN que nous devons analyser sont de petites tailles)

3- Faire fondre le mélange au micro-onde jusqu'à ce que tout l'agarose soit dissous. Laissez refroidir sur la paillasse un moment (environ 5 minutes)

4- Ajouter le colorant (se référer à la notice pour connaitre la concentration indiquée). Nous utilisons environ 2uL de midori green pour 100mL de gel.

5- Préparer la cuve d'electrophorese, puis verser le gel encore liquide dans le moule (ne pas oublier d'utiliser les peignes pour former les puits). Attendre la solidification du gel. Retirer les peignes.

6- Remplir la cuve de tampon de migration (TAE 1X). Placer le gel dans la cuve.

7- Pipetter vos échantillons de PCR dans les puits dans l'ordre. Ne pas oublier d'utiliser une échelle de référence pour la migration.

8- Brancher les électrodes sur le générateur - Utilisez environ 100V. Ca nous arrive souvent d'utiliser 150V pour accélérer la migration et le résultat reste de bonne qualité.

9- Faire migrer environ 20-30 minutes le temps que les fragments d'ADN soient bien séparés les uns des autres.

10- Eteindre le générateur puis sortir le gel. (Attention à ne pas s'électrocuter ici !!)

Temps Total : 30 minutes à 1 heure (gagnez du temps en préparant le gel à l'avance pendant la PCR)

IV Observation des résultats

Pour observer les résultats nous utilisons un transilluminateur excitant à 470nm (ex: le BlueNote) avec un filtre passe-haut ne laissant passer que la lumière au dessus de 515nm. Prendre une photo du gel à travers le filtre pour ensuite pouvoir analyser la taille des bandes plus facilement. En ayant connaissance de la taille des fragments obtenus, vous serez directement en mesure de déterminer l'espèce animale dont la viande que vous avez analysé provient. Lorsque vous avez plusieurs bandes pour un même échantillon c'est que vous faites fasse à un mélange :) Cette méthode est non quantitative, il est donc impossible de déterminer la proportion de boeuf par rapport à du cheval dans un même échantillon par exemple.

Temps Total : 5 minutes

En espérant que ce protocole vous aura plus :)

N'hésitez pas à vous inscrire à nos ateliers DNA barcoding pour pratiquer !!